Tozalash

Tozalash. Kerakli asbob va reaktivlar: gomogenizator, 370С li termostat, texnik tarozi, 50 va 500 ml li o'lchov tsilindrlari, laboratoriya tsentrifugasi, 20 va 50 ml li shprits, 50; 200; 500 ml li stakanlar, shisha tayoqcha, tuzli eritma (tarkibi: 0,15M natriy tsitrat 0,01 M EDTA), xloroform, izoamil spirt, etil spirt, perxlorat kislotaning 57% li eritmasi, etil efir, NaOН ning 0,5 n eritmasi, KOН ning 1 n va 5 n eritmalari, dodentsilsulfatning 20% li eritmasi, NaCl ning 5 m eritmasi, muskul yoki jigar. Dezoksiribonuklein kislota (DNK) o'simlik, hayvon va mikroorganizmlar hujayralarida asosan yadroda, juda oz miqdorda, tsitoplazmada oqsil bilan bog'langan holatda bo'ladi. DNK ni ajratib olish uchun, uni oqsildan ajratish, turli biologik membranalardan tozalash zarur. DNK ni hujayradan ajratib olishda (u RNK bilan aralash holatda bo'ladi), avval uni RNK dan tozalab, so'ngra quritiladi. Ishning bajarilishi. 20 g hayvon to'qimasi (jigar, bo'qoq bezi) 100 ml tuz eritmasi bilan shisha gomogenizatorda maydalanadi. Olingan gomogenatga oxirgi kontsentratsiyasi 2% bo'lguncha 20% li dodetsilsulfat (10-12 ml) qo'shiladi va 370С li termostatga yarim soat qo'yiladi. Hosil bo'lgan yopishqoq eritmaga nukleoproteidlarni dissotsilash uchun oxirgi kontsentratsiyasi 1 m bo'lguncha 5 m NaCl eritmasidan (25-26 ml) qo'shiladi. Gomogenat shliflangan qopqoqli kolbaga o'tqazilib, ustiga 24:1 nisbatdagi xloroform izoamil spirt aralashmasidan 400 ml qo'shib, 10-15 minut yaxshilab, chayqatiladi. Aralashma 50 ml li tsentrifuga probirkalariga quyilib, 30 minut 2500 aylmin tezlikda tsentrifugalanadi. Bu vaqtda tsentrifugat 3 ta fraktsiyaga bo'linadi: yuqori qavatda nuklein kislotalar, o'rta qavatda oqsillar, eng pastki qavatda-xloroformli fraktsiyada lipidlar va organik erituvchida eriydigan boshqa komponentlar qoladi. SHprits yordamida yuqoriga fraktsiya so'rib olinadi va uni eritma tiniqlashguncha xloroform-izoamil spirt bilan ishlash 2-3 marta takrorlanadi. Tarkibida nuklein kislota bor suvli qavatlar birlashtirilib, ikki baravar ko'p miqdorda 96% li etil spirt quyilgan stakanga doimo aylanasiga aralashtirib turgan holatda, asta-sekin quyiladi. Natijada nuklein kislotalarning oq spiralsimon cho'kmasi hosil bo'ladi. So'ngra spiralsimon DNK shisha tayoqcha yordamida oz miqdorda 70% li etanol quyilgan stakanga o'tkaziladi. Bu operatsiya 2-3 marta takrorlanadi. So'ngra nuklein kislotalar cho'kmasi spirt-efir (1:1) aralashmasi va efir bilan yuvilgach, xona temperaturasida quritish uchun qoldiriladi. DNK va RNK ajratish uchun 10-15 mg quruq nuklein kislota preparati 5 ml 0,5 n NaOН da eritilib, 370С li termostataga 18 soat qo'yiladi. Eritma sovitiladi va 57% li perxlorat kislota (HClO4) yordamida neytrallanadi, so'ngra HClO4 kontsentratsiyasi 2% ga yetkuncha kislota qo'shish davom ettiriladi. Hosil bo'lgan DNK cho'kmasi sovitkichli tsentrifugada 10 minut 300 aylmin (300g) tezlikda tsentrifugalash yo'li bilan ajratib olinadi. Olingan DNK cho'kmasi ikki marta 2% li HClO4 2 marta 7% li ...